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    公开号:WO1989001947A1
    申请号:PCT/JP1988/000833
    申请日:1988-08-22
    公开日:1989-03-09
    发明作者:Takashi Muramatsu；Hisako Muramatsu；Hiroshi Inoue；Akira Awaya；Hideo Fukui；Yoshihide Hashimoto
    申请人:Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 生体由来のタンパク質 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 脳 '· 神経系の細胞増殖、 分化あるいは他 の臓器 · 組織の成長 ♦ 発育等に必須であ り 、 その促進 ないし調節に重要な役割を果たし、 脳 · 神経系の異常 に基く疾患、 各臓器 · 組織の成長、 発育の不全あるい は異常増殖および癌等の治療剤および予防剤、 あるい はこれらの-診断用剤などへ適用し得るマウス胎児脳等 よ り単離された分子量約 68, 000、 等電点 5. 4 〜5: 6 で あるタンパク質 （以後 G P 68タンパク質と略称する） に関する。 また、 本発明は該 G P 68タンパク質の分 離精製方法、 該 G P 68タンパク質に対するポ リ クロー ナル抗体およびモノ クローナル抗体、 該モノ クロ一ナ ル抗体生産能を有する八イブリ ドーマならびにこれら 抗体の製造方法に関する。
    [0003] 更に、 該 G P 68タンパク質またはこれら抗体を含有 する上記各種疾患の治療剤、 予防剤、 あるいは診断用 剤と して有用な医薬組成物に関する。
    [0004] .' 背 景 技 術
    [0005] 脳 · 神経糸の組織 · 細胞中に存在するタンパク質等 に関する研究は、 他の臓器や器官に存在する タンパク 質等の研究に比して遅れているものの、 近年多くの知 見が集積されつつある。
    [0006] 例えば、 脳 · 神経系の組織 ♦ 細胞中に存在するタン パク質等と して、 チューブリ ン、 微小管結合タンパ ク質 (microtubule-associated proteins, MAP s) 、 ニューロフ ィ ラメン ト ト リプレッ ト、 グリ ァ鐡維酸性 夕ン ノ ク ( glial fibrillary acidic protein , GFA タ ンパク質） [日本生化学会編、 続生化学実験講座 6、 細胞骨格の構造と機能、 上、 第 1章、 第 2章およ び、 下、 第 9章参照] などが知られている。
    [0007] 脳 ·· 神経系の細胞中に含まれる各種物質、 特に脳 * 神経系の細胞の分化において機能するタンパク質など の検索と、 その機能の分析は、 例えば各種脳 · 神経系 疾患の新しい治療薬および予防薬、 あるいはそれらの 診断方法の関発に有用なタンパク質等を見い出す上 で、 極めて有効な手段である。
    [0008] それ故、 脳 · 神経系の細胞中に含まれる各種物質の 検索およびその機能の分析に対する要請が高まつてい る。
    [0009] このよう な観点から種々の検討がなされているなか で、 脳 * 神経系の細胞由来のタ ンパク質と して、 マ ウス胎児脳に時期特異的に出現する タンパク質の存 在が本発明者 ら に よ っ て既に明 らかにさ れている [特開昭 60— 100597 号公幸艮、 Noguchi, S. , et al ； J. Biochem. , 96, 881 (1984) ] 。
    [0010] また、 ヒ 卜脳 · 神経系腫瘍細胞に特異的に出現する タンパク質の存在が特閧昭 61-233623 号公報に本発明 者らによって開示されている。
    [0011] —方、 マウス、 ラ ト の脳 · 神経系細胞腫などに検 出されるが、 正常マウス脳および正常ラ ッ 卜脳には 検出されないか、 も し く はわずかしか検出されない タンパク質の存在が本発明者らによって開示されてい る [特閧昭 6卜 275221号公報、 および Noguchi, S. , et a 1 ； Cel l Structure and Function, 12, 12 /
    [0012] 発 明 の 開 示
    [0013] 本発明者らは、 上述のよ う に脳 · 神経系の組織 ♦ 細 胞に含まれるタンパク質の重要性に鑑み種々のタンパ ク質等の物質の検索を行なってきたが、 その過程で、 マウス胚 （胎児） の脳に存在する タ ンパク質のなか で、 最もその存在比率が高く 、 脳 ♦ 神経系の異常に基 く疾患、 各臓器 ♦ 組織の成長 · 発育の不全あるいは異 常増殖および癌等の治療剤、 予防剤などへの適用が大 いに期待される二次元電気泳動法で分子量約 68, 000を 示し、 等電点が 5 · 4 〜 5.6 であるタンパク質 （ G P 68 タンパク質） に着目 した。 と ころが、 該 G P 68タンパク質の存在量は極めて微 量であ り 、 また従来の方法では夾雑する各種タンパク 質の混入が避けられない場合が多く 、 高い精製度で量 的に十分な G P 68タンパク質を得るこ とが必要となつ ていた。
    [0014] そこで、 本発明者らは、 よ り効率良い G P 68タンパ ク質の分離精製方法について鋭意検討した結果、 レク チンを担体に結合したァフ ィ 二ティ 一クロマ 卜グラ フ ィーを行なう工程を G P 68タンパク質の単離精製ェ 程に新たに導入する こ とによ り、 夾雑タンパク質の混 入を効果的に排除し、 よ り純度の高い形で、 十分な量 の G P 68タンパク質を効率良く単離精製できることを 見い出した。 更に、 この新たな知見に基いた精製方法 によって十分な量の G P 68タンパク質が得られるよう になり 、 ぞの結果 G P 68タンパク質に対する抗体の生 産に成功し、 またそれを用いた確実な G P 68タンパク 質の分離精製方法を確立するに至り 、 本発明を完成し た。
    [0015] 本発明の目的は、 G P 68タンパク質の性質および機 能を分析し、 その医薬、 動物薬、 あるいは診断薬と し ての有用性を明確とするのに必要な技術である、 量的 に十分なよ り精製度の高い G P 68タンパク質を分離精 製できる方法を提供する こ と にある。
    [0016] 本発明の他の目的は、 例えば、 脳 · 神経系の疾患の みならず各臓器 · 組織の成長 · 発育の不全あるいは異 常増殖および癌等を有する患者のマーカー と しての G P 68タ ンパク質を、 該タ ンパ 質に対する ポ リ ク 口一ナル抗体あるいはモノ クローナル抗体で検出する 各種免疫測定法の閧発に必要な技術、 およびこれら抗 体自身ならびにその製造方法、 あるいは治療剤及び予 防剤と しての該抗体を含有する医薬組成物を提供する し と にめ。。
    [0017] 本発明の他の目的は、 脳神経系はじめ各臓器の成長 · 発育の不全を予防あるいは治療するための G P 68夕 ンパク質を含有する医薬組成物を提供する こ と にあ る。 '
    [0018] 上記目的を達成する本発明は、 マウス胎児脳等よ り 単離された分子量約 68, 000、 等電点 5. 4 〜5. 6 である G P 68タンパク質、 該 G P 68タンパク質の分離精製方 法、 該 G P 68タンパク質に対するポ リ クロ一ナル抗体 およびモノ クローナル抗体、 該モノ クローナル抗体生 産能を有するノ、イブ—リ ドーマならびにこれら抗体の製 造方法及び該 G P S8タンパク質またはこれら抗体を含 有する上記各種疾患の治療剤、 予防剤、 あるいは診断 用剤と して有用な医薬組成物を包含する。 発明を実施するための最良の形態
    [0019] 本発明の G P 68タ ンパク質の第 1 の分離精製方法 は、 G P S 8タンパク質の単離段階に、 レクチンを親和 試薬と して担体に結合 （固定化） して用いたァフ ィ 二 ティ 一クロマ ト グラ フ ィ ーによる工程が導入されてい る こ と に特徵を有する。
    [0020] すなわち、 G P 68タンパク質および例えば種々 の夾 雑タ ンパク質を含む混合物を、 レクチンを担持 （固定 ィ匕） した担体に接触させて該担体に G P 68タンパク質 を吸着させ、 更に該担体から G P 68タンパク質を選択 的に単離する。
    [0021] この工程に用いる こ とのでき る担体と しては、 例え _ ばァガロース、 アク リ ルア ミ ドゲル、 各種 ト ヨパール (東洋曹達工業社製） 、 セルロースなどを挙げる こ と ができる。
    [0022] また、 担体に固定化させる レクチン と しては、 ヒマ 凝集茶 ( Ricinus Communis Agglutinin 、 以下 R C A と 略記す る ） 、 小麦胚ァ グルチニ ン （ Wheat Germ Agglutinin, W G A ) 、 コ ンカナパリ ン Aなどを用い る こ とができ るが、 これらの中では、 R C Aが特に好 適である。
    [0023] レクチンを担体に担持 （固定化） させる方法と して は、 用いる担体およびレクチンの種類に応じて常法に 従っ て行なえば良い。
    [0024] こ れ ら を 用 い て の ァ フ ィ 二テ ィ 一 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一は、 レクチ'ンを担持し た担体を適当な大きさ及 び形状のカ ラ ム に通して利用するカ ラ ム法や、 レクチ ンを担持した担体と処理すべき溶液あるいは榕出用溶 液と を一度に混合して処理するバッ チ方式を用いた方 法など所望に応じて適宜選択した方法によっ て実施す れば良い。
    [0025] このよ う な レクチンを用いたァフ ィ 二ティ 一クロマ 卜 グラ フ ィ 一によ り 、 マウス胎児脳などの各種組織 ♦ 細胞の抽出液のみな らず、 各種精製段階で得られる G P 68タ ンパク質を含む溶液を処理して、 G P 68タン パク質を分離精製する こ とが可能である。
    [0026] マウ.ス組織 ♦ 細胞から G P 68タ ンパク質を分離する 場合に は、 例え ば、 2 % 卜 リ 卜 ン （Triton) X - 100 (ローム ア ン ド ハース 社製） 、 0.005%フ エニル メ チルスルフ ォ ニルフルオラ イ ド （ P M S F ) 、 0. 15 M 食塩を含む 10mM卜 リ ス · 塩酸緩衝液 （ pH7.5 ) 中に マウス組織 * 細胞をホモジナイ ズして所定時間の抽出 操作を行ない、 得られた粗抽出液から遠心分離 （例え ば、 40 , 000 r pm)で得られる上清液を用いる こ とができ る。
    [0027] なお、 この時用いるマウス組織 * 細胞と しては、 受 精か ら生後 1 週間ま での、 例えば、 受精後 U日 目胚〜 19曰 目胚の胎児や、 生後 1 週間のマウ スの脳、 神経組 織、 胃腸管、 平滑筋組織、 肝臓、 心臓、 腎臓、 肺、 脾- 臓等の各臓器などを挙げる こ と ができ るが、 高濃度で の抽出分離を行いたい場合には胎児脳あるいは生後 1 週間位までのマウス脳を用いるのが便利である。
    [0028] レクチンを担持する担体に吸着させた G P 68タンパ ク質は、 溶出用の溶液と して G P 68タンパク質を選択 的に溶出できる組成の溶液を選択して用いる ことによ り、 G P 68タンパク質を溶出させて、 これと他のタン パク質とを分離する ことができる。
    [0029] この溶出用の溶液は、 レクチンおよび担体の種類な どに応じて適宜選択すれば良いが、 例えば、 0.01M 〜 0.2Mのラ ク トース溶液、 N-ァセチルグルコサミ ン溶 液、 α —メチルマンノ シ ド溶液、 シアル酸溶液などを 利用する ことができる。
    [0030] 溶出画分中での G Ρ 68タンパ'ク質の確認は、 その分 子量および等電点の測定などによって行なう ことがで ぎる。
    [0031] 本発明の G Ρ 68タンパク質は、 後述の実施例 1 に記 載の 2次元電気泳動での測定で約 68, 000 ( 68, 000土 2, 000 ) の分子量を有し、 その等電点が 5.4 〜5.6 で ある。
    [0032] 以上のよう な操作によって分画した G P 68タンパク 質を含む画分を、 更に例えばゲル口過法などの必要に 応じたその他の各種精製方法に用いられている各種ェ 程で処理して、 よ り高純度の G P 68タンパク質を効率 良く得る こ とが可能である。 このゲル口過法には、 通常のタ ンパク質精製技術で 用いられている方法が適用できる。
    [0033] このよ う にして得られた純度の高い G P 68タンパク 質は、 後述の実施例 1 に示される アミ ノ酸組成及び糖 組成を有し、 そのアミ ノ末端部分のオ リ ゴペプチ ドの アミ ノ酸配列は、 マウスの α —フ エ 卜プロテイ ンのァ ミ ノ末端のアミ ノ酸配列 [Michael B. Gor in et al. , J. Biol . Chem. , 2^6, 1954 ( 1981 ) ] とほぼ同一であつ た。 また、 糖の含有率は 12.7重量％であっ た。
    [0034] 該 G P 68タンパク質は、 脳 · 神経系はじめ各臓器の 成長 ♦ 発育の不全.を予防あるいは治療するための医薬 と しそ有用な医薬組成物の有効成分と して有用であ る。
    [0035] 次に、 上記 G P 68タ ンパク質を用いて動物を免疫 し、 該 G P 68タンパク質に対する抗体を調製するこ と ができ る。
    [0036] すなわち、 G P 68タンパク質を例えばラ ッ 卜、 ゥサ ギ、 ャギ、 ゥマ、 ゥシなどの動物に免疫し、 得られた 抗血清中に G P 68タンパク質に対するポ リ クロ一ナル 抗体を得る こ とができ る。
    [0037] こ の免疫処理には、 通常の方法が利用でき、 例えば 各種動物の背中、 足踱、 腹腔内、 血管内などに適当な アジュバン 卜 と と もに G P 68タンパク質を接種する。 免疫後、 7〜200 日経過した動物から抗血清を採取し て 目的とするポ リ クロ一ナル抗体を得る こ とができ る。
    [0038] なお、 初回免疫後、 適当な間隔をおいて追加免疫し て抗体価を高める ことができる。
    [0039] 一方、 上記のよう にして免疫した動物や、 Balb/cな どのよう なマウスの脾細胞と骨髄腫細胞 （ミエ口一マ 細胞） 株との融合によって、 G P 68タンパク質に対す るモノ クローナル抗体生産能を有するノイブリ ドーマ を作製するこ とができる。
    [0040] この融合に用いる ミエローマ細胞株と しては、 マウ ス NS - 1株、 X 63 - Ag8株、 MPC-11 株、 SP - 2/0株など のマ ウ ス系の ミ エローマ細胞株ゃラ ヅ 卜 210. RCY. Agl.2.3 などを挙げる こ とができる。
    [0041] また、 G P 68タンパク質で免疫した動物と しては、 初回免疫後 10〜 8 Q曰経過したものが好適である。
    [0042] 更に、 融合は公知の方法で行なえば良く、 得られた ノ イ ブリ ドーマは、 例えば 5〜 20% の牛胎児血清と HAT を含む RPMr培養液 （日水製薬社製、 Code 05911) , 続いて HTを含む RPMI 培養液、 最終的に RPMI培養液な どの細胞培養用培地で培養して、 培地中に所望とする G P 68タンノ ク質に対するモノ クロ一ナル抗体を分 泌、 備蓄させて該モノ クローナル抗体を生産すること ができる。
    [0043] あるいは、 該八イブリ ドーマをヌー ドラ ッ ト、 また は免疫抑制されたラ ッ 卜 の腹腔内に移植してその腹水 癌化を誘発し、 該腹水中に該モノ ク ローナル抗体を生 産、 備蓄させる方法によっ て該モノ ク ローナル抗体を 生産する こ とができ る 。
    [0044] こ う して得られたポ リ ク ロ一ナル抗体およびモノ ク 口一ナル抗体は、 先に述べたよ う に、 各種免疫測定法 によっ て脳 ♦ 神経系の疾患のみならず各臓器 · 組織の 成長 ♦ 発育の不全ある いは異常增殖および癌等を有す る患者の疾患マーカーと しての G P 68タ ンパク質を検 出する際の試薬の成分と して、 ま たこれらの抗体を含 む治療剤および予防剤の閧発に有用である。 一例と し て、 G P 68タンパク質に対する ポ リ クロ一ナル抗体お よびモノ クロ一ナル抗体を用いて各種癌患者の癌組織 を蛍光抗体法に よ り染色してみる と、 癌組織のみにお いて特異的に本発明のこれら抗体によっ て組織 · 細胞 が染色される こ とが明 らか と な り 、 癌の診断薬と して 抗 G Ρ 68タンパク質抗体が有用である こ と が明かとさ れた。
    [0045] ま た、 G P 68タ ンパク質に対する抗 G P 68夕 ンパク 質ポ リ ク ローナルゥサギ （ラ ッ 卜 ） 抗血清及び抗マウ ス α —フ ヱ ト ブロ テイ ンポ リ ク ロ一ナルゥサギ抗血清 と のォク タルロニ一 （ Ouchterlony)法によ るゲル内沈 降反応を行なっ た と こ ろ 、 両抗血清は G P 68タ ンパク 質に対して同様の沈降反応を示し、 マウ ス G P 68タ ン ノ ク質とマゥスひ ーフ ェ 卜プロテイ ン とはここでもか なり近似したタンパク質である こ とが解った。
    [0046] 他方、 同時に行なったォクタルロニ一法によるゲル 内沈降反応で、 G P 68タンパク質に対するゥサギ抗血 清とは異なり、 ヒ 卜胎盤 α—フ エ 卜プロテイ ンに対す るゥサギ抗血清 （へキス ト社製） は G P 68タンパク質 と沈降反応を示さなかった。 これに対応する事実と し て、 ヒ ト癌患者組織抗原をべクタスティ ン A B C法あ る は蛍光抗体法によ り染色してみる と、 両血清の反 応性には明瞭な差異がある こ とが示された （表 1 A及 び表 1 B ) 。 そし 、 抗 G P 68タンパク質抗血清は、 抗ヒ 卜 α—フエ 卜プロテイ ン抗血清よ り もスぺク トラ ムが広く 、' かつ強度が高いこ とが明らかとなつた。
    [0047] また、 こう して得た抗体を用いて作製したァフィ二 ティーク口マ ト担体を用いて本発明における第 2のァ フ ィ ニテ ィ ークロマ ト グラ フ ィ ーを行なう こ と によ り 、 G Ρ 68タンパク質の分離精製を行なう こ とができ る。
    [0048] その際用いる担体と しては、 ァガロース、 セフ ァ デ クス類、 BrCN活性化セフ ァ ロ一ス 4Βのよ う なセ フ ァロース類、 igel 10 (Bio- R ad 社製） 、 各種 'トヨ パールなどを利用するこ とができ、 担体への結合方法 は、 適当な緩衝液などに抗体を溶解し、 4 °Cで数時間 から一昼夜担体とまぜあわせて行なえば良い。 この G P 6 8タ ンパク質に対する抗体を用いたァフ ィ 二テ ィ 一ク ロマ ト グラ フ ィ ーを行な う場合、 吸着した G P 6 8夕 ンパク質を溶出させる溶液と しては、 酸性緩 衝液、 アルカ リ性緩衝液ある いは高濃度の塩を含む中 性緩衝液などが利用でき る。
    [0049] 本発明の G P 6 8タ ンパク質ま たは抗 G P 6 8タ ンパク 質抗体を有効成分と する医薬組成物は、 必要に応じた - 各種添加剤と混合する こ と によ つて調製する こ とがで き る。 該添加剤と しては、 例えばアルブミ ン、 ゼラチ ン、 デキス ト ラ ン、 Twe e n 8 0などのポ リ ソルベー 卜系 等の非イ オン界面活性剤、 ポ リ オキシエチ レ ン硬化ヒ マシ油、 脂肪酸アルコールエステル、 ポ リ グ リ コール エーテル、 リ ン酸緩衝生理食塩水、 各種ア ミ ノ 酸、 デキス 卜 ロ ース、 マ ンニ ト ール、 グルコ ース 、 キ シ リ ト一ル、 乳糖、 シ ョ糖、 ガラ ク 卜 一ス、 フ ラ ク 卜一 ス、 マル ト ース、 サヅ カ ロ一ス、 ソルビ 卜一ルなどの
    [0050] ' 糖類等を挙げる こ と ができ、 これらの 1 種ま たは 2以 上を組み合せて用いる こ とができ る 。
    [0051] 本発明の医薬組成物は、 た と え ば錠剤、 カ プセル 剤、 散剤、 顆粒、 卜 ローチ、 カ シエ—、 エ リ キシル、 乳濁液、 溶液、 シロ ッ プ、 懸濁液、 エ ア ロ ゾル、 軟 一 膏、 ^菌注射器、 '成型パ ッ ,プ、 テープ、 軟質及び硬質 ゼラチンカプセル、 坐薬及び無菌包装粉末な どの形態 と して利用でき る。 更に、 本発明の医薬用組成物は、 製薬的に許容され る担体等の添加剤と して、 上記の例示物の他に、 充塡 剤、 結合剤、 滑沢剤、 湿潤剤、 崩壊剤、 乳濁および懸 濁剤、 保存剤、 希釈剤、 甘味剤あるいは芳香剤等と し て作用する各種物質を含有し得る。
    [0052] これらの添加剤の例と しては、 と う もろ こし澱粉、 結晶セルロース、 アラ ビアゴム、 リ ン酸カルシウム、 アルジネー ト 、 ケィ酸カルシウ ム、 微結晶セル口一 ス、 ポ リ ビニルピロ リ ド ン、 ト ラガカ ン 卜 ゴム— ゼラ チン、 シ ップ、 メチルセルロース、 カルボキシメチ ルセ.ルロース、 メチ.ルヒ ドロキシ安息香酸エステル、 プロ ピルヒ ド ロキシ安息香酸エステル、 タルク、 ステ ア リ ン酸マグネシウム、 不活性なポリマー類、 水及び 鉱油等が挙げられる。
    [0053] なお、 本発明の医薬組成物は、 投薬の後の活性成分 の放出速度が所望に応じて制御されるよう に処方して も良い。 ' 本発明の医薬用組成物を経口投与する場合には、 例 えば G P 6 8タンパク質または抗 G P 6 8タンパク質抗体 は、 上記担体等と混合され、 錠剤、 カプセル剤などの 形とする こ とができる。
    [0054] 静脈内点滴も し く は注射、 あるいは筋肉内注射等の 非経口投与の場合、 例えば G P 6 8タンパク質または抗 G P 6 8タンパク質抗体の有効量を、 ブド ウ糖水溶液、 等張食塩水、 無菌水ある いは類似の液体に溶解し、 バ ィ アルま たはアンプルに密封する こ と ができ る。
    [0055] なお、 バイ アルま たはアンプル剤と した場合には、 その安定性を向上させる ために、 G P 68タ ンパク質ま たは抗 G P 68タ ンパク質抗体の凍結乾燥品をバイ アル やアンプル内で調製しても良い。
    [0056] 本発明の医薬組成物中での G P 68タ ンパク質ま たは 抗 G P 68タ ンパク質抗体の含有量は、 必要に応じて適 宜選択すれば良いが、 例えば単位投薬量形状あた り 、 0. 1 g 〜50mg程度とする こ とができ る。
    [0057] 以下、 実施例、 実験例をも って本発明を更に詳細に 説明するが、 本発明はこれらに限定される ものではな レ、。
    [0058] 実施例 1
    [0059] 100 個の ICR マウス胎児脳 （受精後 13日胚脳） を、 100πι·β の 2¾ ト リ ト ン X — 100 、 0.005¾PMSF、 0.15 M 食塩を含む 10mM卜 リ ス ♦ 塩酸緩衝液 （ PH7.6 ) 中で ホモジェナイズして、 4 t：、 30分の抽出を行ない、 得 られた粗抽出液を 120, 000 X g 、 1 時間の条件の高速 遠心にかけた後、 更に得られた上清液を以下のよ う に して調製し た R C A ァガロース ァフ ィ 二ティ 一クロ マ 卜 グ'ラ フ ィ 一カ ラ ム （ 4m£ ) に通し た後、 上記緩衝 液 40 m で このカ ラ ムを洗浄し た。
    [0060] カ ラ ムへの充塡 ； ' R C Aァガロース ( EY Laboratories 社製） の 4m£ を円筒状カ ラ ム に充塡し、 これを 1 % 卜 リ 卜 ン X— 100 、 0. 005% PMSF を含む 1 OmM卜 リ ス · 塩酸緩衝液 ( pH7.5 ) で処理し平衡化した。
    [0061] 次に該カラムに 1 % ト リ トン X— 10Q 、. 0.005%PMSF を含む 10mM卜 リス ♦ 塩酸緩衝液 （ pH7.5 ) に更に 0. 1 M ラク ト一スを加えた 20 m の溶液を通し、 溶出液を 得た。
    [0062] この溶出液の一部を充分透析して精製タンパク質溶 液を得た後、 これを凍結乾燥してタンパク質標品を得 た。 ,
    [0063] なお、 タンパク質標品の収量は、 100 個のマウス胚 の脳あた り 2. Omg タンパク質であった。
    [0064] また、 タンパク質量は、 ローリ一 （ Lowry ) 法によ り 、 牛血清アルブミン （シグマ社製） を標準と して求 めた。 なお、 以下の各種操作でのタンパク質量の測定 も同様の方法によ り行なった。
    [0065] 一方、 これとは別に、 先の溶出液の残り にェタノ一 ルを最終濃度が 80〜 90%となるよう に加えてェ.タノ― ル沈殿タンパク質を得て、 これをタンパク質標品と し た。
    [0066] 得られたタンパク質標品の一部を以下の条件の二次 元電気泳動にかけて、 その分子量および等電点を測定 した と こ ろ 、 こ の標品から分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜 5.6 のタンパク質のみが検出された。
    [0067] なお、 分子量測定での対照のタンパク質と しては、 い ずれ も シ グマ 社製 の チ ロ グロ ブ リ ン （分子量 330, 000)、 ラク ト フエ リ ン （分子量 88, 000 ) 、 ゥシ血 清アルブミ ン （分子量 67, 000 ) 、 卵白アルブミ ン （分 子量 43, 000) 、 アル ド ラーゼ （分子量 34, 000) を使用 した。 '
    [0068] 二次元電気泳動の条件 ；
    [0069] a ) 一次元目
    [0070] 泳動用媒体と して、 尿素 2.76g 、 30% アク リルアミ ド 0. 67 m£ 、 10% NP-400 1 m£ 、 ア ン ホ ラ イ ン ( pH3.5 -10 ) の 0.25 a £ , 10% 過硫酸ア ン モニ ア 10μ ·β 、 5%テ 卜 ラメ チルエチ レン ジァ ミ ン [ tetra- methylethylenediamine ( TEMED ) 、 半井ィヒ学社製] 0. 14 ra 、 水 0.91 m_G の組成のものを使用 し、 サン プルを こ の一次元ゲルにかけ、 陽極液 と し て 1 OmM H 3 P O4 、 陰極液と して 20πιΜ NaOHをそれぞれ用い、 400Vで 13時間、 次で 8GQVで 1 時間電気泳動を行なつ た。
    [0071] b ) 二次元目
    [0072] —次元泳動後、 ゲルをソジゥム ドデシルサルフヱー 卜 （ S D S ) 試料緩衝液 [ 10% グリ セ リ ン、 5 % /3 — メ ノレ力 プ 卜 ェタ ノ 一ノレ、 23% SDS 、 62.5mM卜 リ ス • 塩酸緩衝液 （ pH6.8 ) ] と平衡化し、 7.5%のァク リ ルア ミ ド ス ラブゲル （ 25mM卜 リ ス、 192mM グ リ シン、 0. 1% SDS) にかけ、 120Vで 4時間の二次元目の泳動を 亍なった。
    [0073] 泳動後、 0. 05% クマシブル一、 10% メチルアルコ一 ル、 10% 酢酸で 1 時間ゲルを染色した後、 更に 10% メ チルアルコール、 10% 酢酸で処理し、 得られた各ス ポ 卜を測定した。
    [0074] 次に、 先に得た G Ρ 6 Sタンパク質の凍結乾燥標品 ( l mgタンパク質） における糖含有率を、 バァティ ら ( Bhatti et al) の方法に従つて、 メ タノ リ シス反応 を行なった後にガス液体クロマ トグラフ ィーにより求 めた。
    [0075] 一方、 該凍結乾燥標品中のシアル酸の含有率を、 0. 05 H2S04を甩いた 80°C、 30分の加水分解反応を行 なった後に、 N acetylneuranUnic acid を標準として 用レ、すこ Thiobarbituric ac i d 反応 ίこよ り求め ：。
    [0076] 更に、 該 G P S8タンパク質の凍結乾燥標品 （タンノ ク質量と してそれぞれ 1 mgあるいは 98 μ g)を 4M HC JS での 100 °C、 4時間の処理あるいは 6M HC_Cでの 105' °C、 24時間の処理によって加水分解し、 得られた加水 分解物中のへキソサァミンあるいはアミノ酸を、 日立 アミ ノ酸分析器 835 型によ り分析した。
    [0077] 以上の分析操作の結果を以下に示す。
    [0078] 糖組成 （モル比） ； ガラ ク 卜 一ス 1 マンノ ース 1.42 フルク 卜 ース 0.32 グルコース 0.07 グルコサミ ン 1.06 ガラ ク 卜 サミ ン 0.10 シアル酸 0.18 酸組成 （モル比）
    [0079] ァスパラギン酸 43.2 ス レオニン 26.1 セ リ ン 35.8 グルタ ミ ン酸 58.4 グリ シ ン 30.2 ァラニン 30.6 システィ ン 6.9 ノ ' リ ン 23.3 メ チォニン 5.2 イ ソロイ シン 9.5 ロイ シン 48.4 チロ シ ン 8.6 フ エ ニソレア ラ ニ ン 17.4 リ ジ ン 26.3 ア ン モニア 90.1 ヒスチジン 10.6
    [0080] アルギニン 18.2
    [0081] プロ リ ン 26.5
    [0082] 更に、 上記 G P 68タンパク質の凍結乾燥標品 （ 105 ； u g)を ^の水に溶解させ、 その ( 71.4 g) をペプチ ド シークェンサ一 ( Ap lied Science 社 Model 477A) に適用して、 そのアミ ノ末端のアミノ酸 配列を分析したと ころ、 以下の結果が得られた。
    [0083] G P 68タンパク質のアミノ末端のァミノ酸配列 ； • Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr- Leu-Asp-Ser-X -Gin - Y -Lys-Thr-G lu-.Lys- ( X 、 Y は未確定）
    [0084] なお、 参考のためにマウス α —フ エ 卜プロテイ ンの ァミノ末端のアミ ノ酸配列 [Michael B. Gorin et al. , J. Biol. Chem. , 256, 1954 〜（1981) ] は以下のとお りである。
    [0085] マウス α—フ エ 卜プロテインのァミノ末端のァミノ 酸配列 ：
    [0086] Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-bly-I le-Ala-Ser-Thr- Leu-Asp-Ser-Ser-Gln-Cys-Val-Thr-blu-Lys- 更に、 G P 68タンパク質 （上記凍結乾燥標品） に対 する抗マウス G P 68タンパク質ポ リ クロ一ナルゥサギ 抗血清 （実施例 2 で調製） 及び抗マ ウス α - フ エ 卜 プ 口 ティ ン ポ リ ク ロ 一ナルゥ サギ抗血清 （へキス ト 社 製） のォク タルロニ一 （Ouchterlony) 法によ るゲル内 沈降反応を行なっ た と こ ろ 、 両抗血清は G P 88タンパ ク質に対して同様の沈降反応を示し た。
    [0087] 実施例 2
    [0088] 実施例 Γで得た G Ρ 68タ ンパク質の凍結乾燥標品と ェタノ，一ル沈殿標品の 1 ： 1 での混合物 1 DQ H g を、 2週間おき にフ ロイ ン 卜 の完全アジ ュバン ト （半井化 学社製） と と も に計 4回ゥサギ （ニュージーラ ン ドホ ワイ 卜種） の足踱に接種して これを免疫した。
    [0089] 最終免疫後 10曰 目 に全採血し、 血清を調製した。 得 られた血清は、 BSA を結合し た Afigel 10 (Bio Rad Laboratories社製） カ ラ ム に通 し 、 流出液を更に、 lmg/ mjg濃度の G P 68タ ンパク質を含む重炭酸ナ 卜 リ ゥ ム緩衝液 （PH 8.0)と接触させた Aiigel 10 を充塡し たカ ラ ムに通し、 抗体を吸着させた。 次に、 3M のチ オシアン酸カ リ ウム溶液で吸着抗体を溶出させ、 流出 液を集めた。 この操作を必要な回数繰 り 返し抗体溶液 を備蓄した。
    [0090] この抗体を含む流出液を充分透析し、 2D u g/ m^の タ ンパク濃度と し、 ィ ムノ ブロ ッ テ イ ング法によ り分 析し た と こ ろ、 G P 68タ ンパク質に対するポ リ クロー ナル抗体が含まれている こ と が確認'された。 ， 実施例 3
    [0091] 実施例 1 で得た G P 6 8タンパク質の凍結乾燥標品と エタノール沈殿標品の 1 ： 1 での混合物 500 μ g を、 2週間おきにフロイ ン 卜の完全アジュバン 卜 と ともに 計 4回ャギの各所皮内、 皮下に投与して、. これを免疫 し、 経時的に採血した。
    [0092] 十分抗体価が上った 5箇月後に全採血した。 得られ た 清を実施例 2 と同様にカラム処理して、 G P 68タ ンパク質に対するポリ クロ一ナル抗体を 積し、 その 一部を分析したと ころ、 G P 68タンパク質に対する特 異的抗体であるこ とが確認された。
    [0093] 実施例 4
    [0094] 免疫する動物と してゥマを用いる以外は実施例 3 と 同様にしてポ リ クロ一ナル抗体を集積した。
    [0095] 実施例 5
    [0096] 免疫する動物と してゥシを用いる以外は実施例 3 と 同様にしてポ リクローナル抗体を集積した。
    [0097] 実施例 S
    [0098] 実施例 1 で得た G P 6 8タンパ.ク質の凍結乾燥標品と エタノール沈殿標品の 1 ： 1 での混合物を以下に示す 量で、 2週間間隔でウィスターラ ト （ 5〜 6週令） に投与し、 これを免疫した。
    [0099] 1 回目 （皮下） 5 0 μ g
    [0100] 2 回目 （皮下） 5 0 g 3回目 （腹腔内） ΙΟΟμ g
    [0101] 4回目 （腹腔内） ΙΟΟμ g 最終免疫から 3 曰目の脾細胞の 1 X 108 個と、 ミエ ローマ細胞と してのマウス NS-1細胞株の 2 X 107 個と をポリエチレングリ コール 400の存在下で Koehler ら の方法に従って融合させた。
    [0102] ポ リ エチ レ ングリ コールを除き、 得られた八イブリ ドーマを 200πΐ·βの HAT 培地 ( HAT 及び 10% fetal calf serum (FCS) を含む RPMI 1640 medium) に浮遊させ、 これを 96ゥエルプ,レ一 卜 （ Falcon社製） に各ゥエル当 りの細胞数が 1 X 105 個となるよ う に移した。
    [0103] 次に 37°Cで 1 週間〜 10日培養を続けた。
    [0104] 培養 10日目よ り 3 日ごと に各ゥエル培養上清の半分 を用いて （その分新しい培養液を加えて培養を続ける ) 、 ベクタステ ィ ン ABC 法 (Vectastain ABC method, アビジン一 ピオチン化ヮサビペル才キシダ一ゼコンプ レッ クス法、 フナコ シ社販売） による EL ISA (enzyme linked i mmu no sorbent a s s ey )を なレヽ、 陽'性クロ一 ンを含むゥエルを検索し、 更に陽性のものを含むゥェ ルから限界希釈法による クローニ ングを行なって所望 とするクローンを得た。
    [0105] なお、 E L I SA 法に用いたアツ セィ プレー ト 2 0 9 5 (Falcon社製） には、 常法に従い実施例 1 で得たエタ ノール沈殿 G P 68タンパク質を溶解したリ ン酸緩衝生 理食塩水 （以下 PBS)と 1 〜数時間接触させる こ とに よって、 各ゥエルに G P 68タンパク質を lOOr^ 吸着さ せて使用した。 '
    [0106] 以上の操作で、 計 8個の陽性ク ローンが得 られ た。
    [0107] これらのクローンのう ちの 2種 （ EBR 3 、 EBR 7 ) をそれぞれ個々 に用いて以下のよう にして EBR 3-1 モ ノ クロ一ナル抗体、 EBR 7-1 モノ クローナル抗体を得 た。
    [0108] な-お、 これらクローン EBR 3及び EBR 7は、 昭和 63 年 （ 1988年） 8月 18日付けで、 通商産業省工業技術院' 微生物工業技術研究所 （曰本国茨城県つく ば市東 1丁 目 1番 3号、 郵便番号 3Q5) にブタペス ト条約に基い て寄託された。
    [0109] これらクローンの原寄託日は、 昭和 63年 （ 1988年） 8月 18日 であ り 、 クローン EBR 3 の受託番号は FERM BP-2002 、 クローン EBR 7の受託番号は FERM BP-2003 である。 '
    [0110] 実施例 7
    [0111] 実施例 6 で得たハイブリ ドーマ （クローン EBR 3 、 EBR 7 ) を用いた G P 68タ ンノ ク質に対するモノ ク ローナル抗体の生産を実施した。
    [0112] まず、 クローン EBR 3 、 EBR 7 を別々 に RPMI 1640 培地で、 1 Ocroシャー レ中で培養した。
    [0113] 得られた 2種の培養上清から 50% 硫安で沈殿した沈 殿物を 1〜 2 m£ の PBS に溶解し、 3 日間 PBS で透析 した。 次いで、 透析処理後の溶液をセフ ア デツ クス G - 250 カ ラ ムに通し、 精製 EBR 3-1 モノ クロ一ナル抗 体および精製 EBR 7-1 モノ ク ローナル抗体を得た。
    [0114] 更に、 プ リ スタン処理 [ 2, 6, 10, 14-テ 卜 ラメ チルぺ ン タデカ ン 0. 5m £ノ匹を腹腔内に投与し、 1 〜 2週飼 育する ] した 8週令ヌー ド ラ ッ 卜 に実施例 6 で得られ たク ローン EBR 3、 EBR 7 を個々 に 1 X 107 匹と な る よ う に腹腔内に投与し た。 10〜 21日 目 に腹水のた ま っ たラ ッ 卜 から腹水 （ 50 / 匹） を採取し、 こ'れ から遠心分離によ り 固形分を除去した。
    [0115] . 得られた上清を 50% 硫安塩析、 40% 硫安塩折-し、 更 に PBS ( pH7. 2 ) で 3 日間透析し た。
    [0116] 得られた粗精製モノ ク ローナル抗体は、 セフ アデッ クス G — 200 カ ラ ムにかけて、 PBS で溶出させ、 精製 モノ ク ローナル抗体 （ EBR 3-2 モノ ク ローナル抗体お よび EBR 7-2 モノ ク ローナル抗体） をそれぞれ個々 に 含む 2 種の溶液を回収し た。
    [0117] 実施例 8
    [0118] ノ、イ ブ リ ドーマの形成に、 ウィ ス ターラ ッ 卜 の代 り に Balb/cマ ウ スを用いる以外は、 実施例 6及び実施例 7 と 同様の操作を繰 り 返 して、 精製モノ ク ロ ーナル抗 体 （EBR 3-3 モノ クローナル抗体および EBR 7-3 モノ クロ一ナル抗体） を得る こ とができた。
    [0119] 実施例 9
    [0120] 常法に従って、 Afigel 10 と実施例 2で得られたポ リ ク口一ナル抗体の緩衝液溶液とを 4 °Cで 1 昼夜接触 させる方法を用いて、 ポリ クロ一ナル抗体を固定化し たカラムを作製した。
    [0121] このカ ラムで、 実施例 1 で得たマウス胎児脳抽出液 を処理したと こ ろ、. G P 68タ ンパク質を効率良く単 離、 精製する こ とができた。
    [0122] 実施例 10
    [0123] 実施例 7で得た精製モノ クローナル抗体、 EBR 3-1 モノ クローナル抗体および EBR 7-1 モノ クローナル抗 体） をそれぞれ用いる以外は実施例 9 と同様にしてマ ウス胎児脳抽出液を処理したと こ ろ、 G P 68タンパク 質を効率良く単離、 精製する ことができた。
    [0124] 実施例 11
    [0125] 実施例 1 で得た精製タンパク質溶液 （ R C Aァガ ロースカ ラムからの溶出液を透析処理して得たもの） を、 1 ノ ィ アル中（J P 68タンパク質の 100 g が含ま れるよう に充塡し、 凍結乾燥させた後、 これに Tween 80を 0.001 〜0.1 %となるよう に加えた生理食塩水溶 液 1.0m£ を加えて栓をして、 G P 68タンパク質を有す る医薬組成物を得た。 実施例 12
    [0126] Tween 80の代 り に、 アルブミ ンを 0.001 〜 10% と な る よ う に加え た生理食塩水溶液を用いる以外は実施例 11と 同様に して G P 68タ ンパク質を有する医薬組成物 を得た。
    [0127] 実施例 13
    [0128] Tween 80の代 り に、 マンニ ト ールを 0 · 01〜 5 % とな る よ う に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実施例 11と 同様に して G P S8タンパク質'を有する医薬組成物 を得た。
    [0129] 実施例 14
    [0130] Tween 80の代 り に、 グルコースを 0.01〜5 % となる よ う に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実施例 11 と 同様に して G P 68タ ンパク質を有する 医薬組成物を · 得た。
    [0131] 実施例 15a 〜 15d
    [0132] 1 ノ ィ ァノレ中 P 68タ ンノ ク質の量を lmg と なる よ う に凍結乾燥を行な う以外は、 実施例 11~ 14と同様に して G P 68タ ンパク質を有する医薬組成物をそれぞれ 得た。
    [0133] 実施例 16
    [0134] 実施例 7 で得た 2 種の精製モノ ク ロ一ナル抗体を含 む溶液をそれぞれ個々 に用い、 1 バイ アル中抗 G P 68 タ ンパク質モノ ク ローナル抗体の 100 /i g が含まれる よう に充塡し、 凍結乾燥させた後、 これに Tween 80を ο. οσι 〜 0.1 % と なる よ う に加えた生理食塩水溶液 1. Οιπ·β を加えて栓をして、 抗 G Ρ 68タンパク質モノク ローナル抗体を有する医薬組成物を得た。
    [0135] 実施例 Π
    [0136] Tween 80の代り に、 アルブミ ンを 0.001 〜 10%とな るよう に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実施例 16と同様にして抗 G P S8タンパク質モノ クロ一ナル抗 体を有する医薬組成物を得た。
    [0137] 実施例 18
    [0138] Tween 80の代り に、 マンニ トールを 0.01〜 5 %とな るよう に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実施例 16と同様にして抗 G P 68タンパク質モノ クロ一ナル抗 体を有する医薬組成物を得た。
    [0139] 実施例 19
    [0140] Tween 80の代り に、 グルコースを 0· (Π〜5 %となる よう に加えた生理食塩水溶液を用 J/、る以外は実施例 16 と同様にして抗 G P 68夕ンパク質モノ クロ一ナル抗体 を有する医薬組成物を得た。
    [0141] 実験例 1
    [0142] 実施例 2で得たポリ クロナ一ル抗体を用いたマウス 胚および生後 1 〜 30日のマウスの各臓器の 卜 リ ト ン X - 100による抽出物のウェスタンブロ ッ 卜法による分析 を以下のよう にして実施した。 ま ず、 マ ウ ス （ 13日胚） お よびマ ウ スの各臓器 (脳、 神経節、 心臓、 肺、 肝臓、 胃腸管、 脾臓等） を 用い以下のよう にして処理し抽出物を得た。
    [0143] 試料を 2 % 卜 リ 卜 ン Χ-100、 50μ g /m の PMSFを含 む 0.01 M卜 リス ♦ 塩酸緩衝液中でホモジェナイズし、 氷上で 30分間抽出を行なっ た。 得 られた抽出液を 40, OOOrpm 、 一時間の遠心分離処理し、 得られた上清 液をエタノール沈殿処理した。 こ こ で得られた沈殿に 含まれるタンパク質量を口一 リ ー法によ り定量してお いた。
    [0144] ？欠に、 レム リ ( Laemmi i)の方法（Nature , 227 , 680 〜685 , 1970 ] に従って、 S D S可溶化溶液 [ 9.5 M 尿素 2% NP-40 (半井社製） 、 2¾ア ンホ ラ イ ン （フ ア ル マ シ ア社製） 、 5%メ ルカ プ 卜 ェタ ノ 一ノレ、 0. 25% S D S ] に沈殿物が 4 mg/m £ (最終濃度） となるよう に溶解し、 これを S D S—ポ リ アク リルアミ ドゲル電 気泳動 （ゲル濃度 10¾ 、 10〜 15 £ / レーン '、 すなわ ち 40〜 60 μ g タンパク質ノレーン ）にかけた。
    [0145] 泳動が終了 し た後、 ト ウ ビ ン ら の方法 [ Towbin et a 1 , Proc. Nat . Acad. Sci . , 7_6, 4350~ 4354, 1979 ] に従って、 上記の分画された各タンパク質の位 置を保ち なが ら、 こ れ ら をニ ト ロ セル一ロ ース膜 ( Schleicher & Sc hu e 11社製または B i o - R a d 社製） に ブロ ^ テイ ングした （ 1 アンペアで 2時間） 。 ブロッテイ ング終了後、 ニ トロセル一口一ス膜を 3 %ゥシ血清アルブミン （BSA)を含む PBS と室温で 1 時 間接触させた。
    [0146] その後、 二 卜 ロセル一ロース膜を 1 % ト リ ト ン X- - 100 を含む PBS で洗浄後、 これを実施例 2 で得た抗 G P 68タンパク質に対する抗体 （ 100 〜50Q 倍に希釈 したラ ッ 卜あるいはゥサギ血清） で 2〜 3時間室温で 処理した。
    [0147] - 更に、 1%卜 リ 卜 ン X-100を含む PBS での 1 時間の洗 淨を数回行なった後、 HRP (horse radish peroxidase, Cappel社製） 結合抗ラ 卜 IgG あるいは抗ゥサギ IgG マウス IgG 抗体（' 100 倍希釈） を含む溶液で 1 時間処 理した。
    [0148] 次に、 1 % ト リ ト ン X- 100を含む PB S での 1 時間の 洗浄を 5 〜 6 回行なっ た後、 0.05% の A-ciiloro-l- naphtol の 40mMト リ ス ♦ 塩酸溶液 （PH7.6)で膜を処理 し、 灰褐色に染色されたバン ドの出現を目視で観察し た。
    [0149] その結果マウス胚の各組織の抽出物では、 どの抽出- 物からも染色されたスポッ 卜が検出された。
    [0150] 例えば、 i3、 15及び 17日胚の頭部、 腹部及び尾部の 抽出物のいずれにおいても染色されたスポ 卜が検出 された。
    [0151] —方、 生後 1 〜 7 日のマウスの各組織 ' 細胞からの 抽出物において も染色さ れたスポ ッ 卜 が検出 さ れ た。
    [0152] 例えば、 誕生直後のマウスの頭部、 腹部及び尾部の 抽出物のいずれにおいても染色されたスポッ 卜が検出 され、 更に生後 7 日 目のマウ スの脳、 肝臓、 腎臓、 肺、 心臓、 皮膚、 脾臓、 筋肉からの抽出物のいずれに おいても染色されたスポ ッ 卜 が検出された。 こ の う ち、 肝臓、 心臓の染色の程度は強く 、 脳はびまん性の 弱い染色を した。
    [0153] これに対して、 生後 1 週間を越えたマウ スの各組 辯 ' 細胞からの抽出物では染色されたスポッ 卜は全く 検出されなかっ た。
    [0154] 例えば、 生後 1 4 日、 2 1 日のマウスの脳、 肝臓、 腎臓、 肺、 心臓、 皮膚、 脾臓、 筋肉からの抽出物、 及 びマウス成体の脳、 肝臓、 腎臓、 肺、 心臓、 皮膚、 脾 臓、 筋肉、 子宫、 脊髄からの抽出物のいずれにおいて も染色されたスポッ 卜は検出されなかった。
    [0155] 従って、 G P 6 8タンパク質は、 增殖あるいは分化の. 極めて盛んな胎児および生後間もない時期に特異的に 出現する生物活性を有するタンパク質である と考えら れる 。
    [0156] 実験例 2
    [0157] マ ウス 1 5曰胚を ド ラ イ アイ スァセ 卜 ン中で急冷し て、 ク リ オスタ ツ 卜 で切片を切り 出し、 これらに実施 例 7 で得た EB R 3-1 モノ ク ローナル抗体および E B R 7-1 モノ クローナル抗体を含む溶液のそれぞれの 10倍 希釈液を個々 に加え、 更にこれらに HRP 結合抗ラ ッ 卜 IgG マウス IgG 抗体を 1 〜 2週間反応させ、 洗浄後染 色する臓器を光学顕微鏡で観察した。 また、 実施例 6 に示した ABC を用いて更に観察した。
    [0158] その結果、 EBR 3-1 モノ クローナル抗体では神経お よび平滑筋が染り、 また EBR 7-1 モノ クローナル抗体 では脳、 神経節、 肝臓が染つたこ とが観察された。 実験例 3
    [0159] -経曰的にマウス胚の脳細胞を取り 出し、 組織培養を 行なった。 これに実施例 7で得られた EBR 3-1 モノ ク 口一ナル抗体および EBR 7-1 モノ クローナル抗体を加 え、 脳細胞の活動を観察した。 ' 実験例 4
    [0160] 実施例 2で得た抗マウス G P 68タンパク質ゥサギ抗 血清及び抗ヒ 卜 α —フエ 卜プロテインゥサギ抗血清を それぞれ用いて、 前記 A B C法によ り各種癌患者の癌 組織の染色を行なつた。
    [0161] 得られた結果を表 1 A及び表 1 B に示す。 なお、 評 価結果における、 「一」 は染色せず、 「 十 — 」 は弱い かつびまん性の染色、 「 十 」 は中程度の染色、 「 + + 」 は顕著だが 「 + + 十 」 よ り は弱い染色、 「 + + 十 」 は顕著な染色を示す。 一方、 同様に行なっ たマウス線維芽細胞、 健常人の 各細胞、 及び癌患者の癌組織以外の正常組織細胞では 何ら染色されず、 抗マウス G P 6 8タンパク質ゥサギ抗 血清は、 癌組織抗原特異的に反応する抗体を有するこ とが示された。
    [0162] また、 表 1 A及び表 ί B に示されるよ う に、 抗 G Ρ 6 8タンパク質ゥ.サギ抗血'清は、 抗ヒ ト ct —フ エ トプロ ティ ン ゥサギ抗血清が染色しない癌患者組織を染色 し、 かつ染色強度も後者に比べて、 弱いものではな く 、 同等かそれ以上の強度を示すこ とが歴然であり、 癌診断薬の成分と しての,有用性の高いものであるこ と がわかった。
    [0163] 表 1 A 症例番号 診 S fi里 器官 抗 G P 68タン 抗ヒ卜 α—フエ パク質ゥサギ 卜プロテインゥ 抗血清 サギ抗血清
    [0164] 1 ヒ卜 13週胚 + + + + + +
    [0165] 2 m、/
    [0166] 星状細胞腫 一 一
    [0167] 3 n )) + -
    [0168] 4 ノ / ノノ ― 一
    [0169] 5 ノノ n 一 一
    [0170] 6 ノノ n 十一 +—
    [0171] 7 頭蓋咽頭腫 ノノ 十一 +—
    [0172] 8 多形性
    [0173] 神経膠芽腫 n ― ―
    [0174] 9 神経膠腫 ノノ 十一 + -
    [0175] 1 0 未熟型奇形腫 ノノ 十一 ―
    [0176] 1 1 髄芽細胞腫 ノノ 十一 + -
    [0177] 1 2 ノノ ノノ 十一 + -
    [0178] 1 3 髄膜腫 n ― ―
    [0179] 1 4 η ノノ 一 一
    [0180] 1 5 ノ / n +— +—
    [0181] 1 6 ノ / ノノ 十一 +—
    [0182] 1 7 ノノ ノノ 十一 +—
    [0183] 1 8 原始外胚葉腫 // 一 一
    [0184] 1 9 殆ど正常肝臓 肝臓 +— 十一
    [0185] 2 0 胆管腫 ノノ + + 十一
    [0186] 2 1 ノノ ノノ 4- + + +—
    [0187] 2 2 肝癌 ノノ ― 一
    [0188] 2 3 ガ )) + + +
    [0189] 2 4 n ノノ -1—— '
    [0190] 2 5 ノノ ノノ + +
    [0191] 2 6 )) ノノ 十一 十一
    [0192] 2 7 // ノノ 十一
    [0193] 2 8 ノノ ノノ + 十一
    [0194] 2 9 n ノノ + +
    [0195] 3〇 ノノ スノ
    [0196] 3 1 )1 ノノ + + +
    [0197] 3 2 肝硬変 ノス + 十一
    [0198] 3 3 ノノ // 十一 + -
    [0199] 3 4 ノ / ノノ +
    [0200] 3 5 ノ / ノノ +— 表 1 B 症例番号 診断癌種 器官 抗 G P 68タン 抗ヒ卜 α—フエ パク質ゥサギ 卜プロテインゥ 杭 fftl清 サギ抗血清
    [0201] 3 6 腺癌 肺 + + 一
    [0202] 3 7 肺腺癌 ノノ + 一
    [0203] 3 8 ノノ ノノ + + ―
    [0204] 3 9 ノノ ノノ +— 一
    [0205] 4 0 ；; ノノ +— 一
    [0206] 4 1 卵巣 + + +
    [0207] 4 2 ノノ + + + +
    [0208] 4 3 腺癌 + + 一
    [0209] A A ノノ ノノ + + + +
    [0210] 4 5 ；/ ノノ + +
    [0211] 4 6 分化型腺癌 ノノ + + 十一
    [0212] 4 V 胎牛癌 +
    [0213] 4 8 ノノ ノゾ +
    [0214] 4 q ' ノノ ノノ 1 + + +
    [0215] ノノ ノノ + + +
    [0216] 5 1 ノノ ノノ + + 十一
    [0217] 5 2 ノノ ノノ + + +
    [0218] 5 3 ヒ皮腫 " + ―
    [0219] 5 4 ノノ ノノ + ―
    [0220] 5 5 ノノ ノノ + + 一
    [0221] 5 6 ノノ ノノ + +—
    [0222] ノノ ノノ 十一 十一
    [0223] 5 8 ガ ノノ + + +
    [0224] 5 9 ノノ ノノ + +
    [0225] 6 0 ノノ ノノ + +
    [0226] 6 1 ノノ ノノ + +
    [0227] 6 2 ノノ ノノ +
    [0228] 6 3 ノノ ノノ +
    [0229] 6 4 ノノ ノ + +
    [0230] 6 5 ノノ η + +
    [0231] 6 6 ガ η +
    [0232] 6 7 ノノ ノノ +
    [0233] 6 8 ノノ ' η +
    [0234] 6 9 変形分化腺
    [0235] 癌 子宮 + + 産業上の利用可能性
    [0236] 本発明によ り、 脳 ♦ 神経系の発生分化の過程で時期 特異的に消長し、 その発生分化の過程で、 重要な役割 を果す可能性のある G P 68タンパク質が単離された状 態で提供されだ。
    [0237] また、 本発明の精製分離方法によ り十分な量の純度 の高い G P 68タ ンパク質を得る こ と が可能と なつ た。
    [0238] 更に、 本発明の G P S8タンパク質に対する抗体を用 いる こ と によ り 、 該抗体を用いた各種研究の促進が容 易となる。 · ·
    [0239] 本発明の G P 68タンパク質は、 受精から生後 1週間 までの特定な時期にしか存在せず、 成体においてはそ の生産が欠失している ことがら、 該タンパク質を成体 に投与して新たな機能の発現が期待できる。
    [0240] また、 本発明の G P 68タンパク質は生体各器官、 組 織、 細胞、 膜の発育促進、 遺伝的、 器質的な各臓器 · 組織の成長 · 発育の不全の解消 * 回復、 脳 · 神経系の 再生 ♦ 修復などの効果が期待できる。
    [0241] 本発明によ り G P 68タンパク質に対するポリ クロー ナル抗体およびモノ クローナル抗体が得られたことに よって、 G P 68タンパク質をコー ドする m-RNA および c-DNA の調製が容易となり 、 遺伝子組み換え技術を用 いた例えぼ大腸菌、 枯草菌、 酵母、 各種動物細胞を宿 主と した G P 68タ ンパク質の生産への道がひらかれ た。
    [0242] G P 68タンパク質あるいはそれの活性中心べプチ ド およびそれらに特異的な抗体は、 各種脳 ♦ 神経系疾患 の治療剤、 予防剤、 また各種成長 · 発育促進剤、 各種 成長不全治療剤あるいは異常増殖、 腫瘍、 癌などの医 薬、 動物薬、 または脳 · 神経系疾患、 各臓器 ♦ 組織の 成長 · 発育不全あるいは異常增殖および癌などの疾患 のマーカ一、 更には診断薬と しての有用性が期待され る。
    [0243] ^ ' 寄託微生物へめ言及
    [0244] 1 . クローン EBR 3
    [0245] 寄託機関 ；
    [0246] 名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研 究所
    [0247] 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号
    [0248] (郵便番号 305)
    [0249] 寄託日 ； 昭和 63年 （ 1988年） 8月 18日
    [0250] 受託番号 ； F E R M B P — 2 0 0 2
    [0251] (ブタぺス 卜条約に基づいた寄託） 2 . クローン EBR 7
    [0252] 寄託機関 ：
    [0253] 名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研 究所 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号
    [0254] (郵便番号 305)
    [0255] 寄託日 ； 昭和 63年 （ 1988年） 8月 18日
    [0256] 受託番号 ： F E R M B P - 2 0 0 3
    [0257] (ブタべス ト条約に基づいた寄託）
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲
    1 ) 受精から生後 1 週間までの生体に特異的に見い出 され.、 分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜5.6 であるこ とを特徵とするタンパク質。
    2 ) 前記生体がマ ウ スである請求項 1 記載のタ ンパ ク質。
    3 ) 受精から生後 1 週間までのマウス組織あるいは細 胞の抽出液から、 レクチンを親和試薬と して用いた ァフ ィ 二ティ 一クロマ トグラフ ィ ーによ り単離され たものである請求項 1 記載のタンパク質。
    4 ) 受精から生後 1 週間までの生.体の組織あるいは 細胞の'抽出液を レクチンを担持した担体と接触さ せる過程と、 該担体に吸着し た成分から分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜5.6 であるタンパク質を選択 的に溶出し単離する過程とを含むこ とを特徵とする タンパク質の製造方法。
    5 ) 前記抽出液が、 受精から生後 1 週間までのマウス 組織または細胞の抽出液である請求項 4記載の製造 方法。 .
    6 ) 受精から生後 1 週間までの生体に特異的に見い出 され、 分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜5.6 であるこ とを特徵とするタンパク質を動物に免疫する過程を 経て得られる こ とを特徴とする該タンパク質に対す るポ リ クローナル抗体。 ) 前記生体がマウスである請求項 6記載のポ リ ク ローナル抗体。
    ) 受精から生後 1 週間までの生体に特異的に見い出 され、 分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜5· 6 である夕 ンパク質で免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞株と の融合に'よ り得られ、 該タンパク質に特異的である モノ クローナル抗体生産能を有する こ とを特徵とす るノ、イブリ ドーマ。
    ) 前記生体がマ ウスである 1青求項 8記載のノイブリ ドーマ。
    1 ひ )- 受精から生後 1週間までの生体に特異.的に見い 出され、 分子量約 6 000、 等電点 5.4 〜 5.6 である タンパク質に特異的であるこ とを特徴とするモノ ク ローナル抗体。
    1 1 ) 受精から生後 1週間までの生体に特異的に見い 出され、 分子量約 68, 000、 等電点 5.4 〜5.6 である タンパク質で免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞株 との融合によ り得られた八ィブリ ドーマに.より生産 されたものである請求項 1 0記載のモノ クローナル 抗体。
    1 2 ) 前記生体がマウスである請求項 1 1 記載のモノ クローナル抗体。
    1 3 ) 受精から生後 1 週間までの生体に特異的に見い 出され、 分子量約 68, 030、 等電点 5.4 〜5.6 である タ ンパク質で免疫 した勣物の脾細胞と骨髄腫細胞株 と を融合させる こ と によ り 八イ ブ リ ドーマを得る過 程 （A ) と、 得られたハイ プ リ ドーマから前記タ ンパ ク質に対するモノ クローナル抗体の生産能を有する 八イ ブ リ ドーマを選択 し、 該選択さ れたハイ プ リ ド一マに前記モノ ク ロ一ナル抗体を生産させる過程
    ( B ) と を有する こ と を特徵とする前記タ ンパク質に 対する モノ ク ローナル抗体の製造方法。
    1 4 ) 前記過程 （B ) が、 前記モノ ク ロ ーナル抗体生 産能を有するハイ プリ ドーマを組織培養液中で培養 し、 該培養液内に前記モノ ク ローナル抗体を生産、 備蓄させる過程か らな り 、 その ii、 該培養液から前 記モノ ク ローナル抗体を分離する請求項 1 3記載の モノ クローナル抗体の製造方法。
    1 5 ) 前記過程 （B ) が、 前記モノ ク ロ ーナル抗体生 産能を有するハイ ブリ ドーマを、 ヌー ド ラ ッ 卜 また は免疫抑制されたラ ツ 卜 の腹腔内に移植してその腹 水癌化を誘発し、 該腹水中に該モノ クローナル抗体 を生産、 備蓄させる過程か らな り 、 その後、 該腹水 か ら前記モノ ク ローナル抗体を分離する請求項 1 3 記載のモノ ク ロ一ナル抗体の製造方法。
    1 6 ) 前記生体がマ ウ スであ る請求項 1 3 〜 1 5 の いずれかに記載のモノ ク ローナル抗体の製造方法。 1 7 ) 請求項 1 記載の タ ンパ ク 質に対す る抗体を担 持した担体に、 請求項 1記載のタンパク質を含む混 合物を接蝕させる過程と、 該担体に吸着した成分か ら該タンパク質を選択的に溶出し、 単離する過程と を含むことを特徵とするタンパク質の分離方法。 8 ) 前記抗体が請求項 6記載のポ リ クローナル抗 体である請求項 1 7 に記載の分離方法。
    9 ) 前記抗体が請求項 1 0記載のモノ クローナル 抗体である請求項 1 7 に記載の分離方法。
    0 ) 請求項 1 記載のタンパク質を含有する こ とを 特徴とする医薬組成物。
    1 ) 請求項 6記載の抗体を含有する こ とを特徴と する医薬組成物。 ' 2 ) 請求項 1 0記載の抗体を含有する こ と を特徴 とする医薬組成物。
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    法律状态:
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    1989-03-09| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1989-04-18| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988907375 Country of ref document: EP |
    1989-09-13| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988907375 Country of ref document: EP |
    1993-11-18| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1988907375 Country of ref document: EP |
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    JP62/207403||1987-08-22||
    JP20740387||1987-08-22||
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